В предыдущей главе мы рассматривали фотоэлектрические процессы, происходящие в молекуле родопсина и фоторецепторной мембране. Основным следствием этих процессов являются такие изменения в молекуле зрительного пигмента, которые приводят к его взаимодействию со специфическим трансдуцином на этапе активации, фосфорилированию и связыванию с арестином на этапе инактивации. Активация трансдуцина достигается при его взаимодействии с активированным родопсином и обмене в связанном состоянии ГТФ на ГДФ. Затем комплекс диссоциирует и активирует фосфодиэстеразу путем замещения ее ишибиторной субъединицы. Трансдуцин обладает ГТФазной активностью, и гидролиз ГТФ возвращает молекулу в исходное состояние.
Область поры ЦН-канала. В настоящее время полагай IT, что петля между S5 и S6 трансмембранными сегментами (П-область) потенциал-зависимых каналов и гомологичных им ЦН-каналов формирует внутреннюю часть канальной поры. Этот участок канала формирует петлю, вытянутую в направлении центральной оси канала. Помимо того, что П-область является ионселективным фильтром, она функционирует как канальный запирающий механизм, структура которого изменяется, когда канал открывается. Область поры контролирует как проводимость одиночного канала, так и собственно диаметр поры канала. Важной задачей является выяснение того, как ион проникает через канал и каков механизм ионной селективности.
В фоторецепторах постоянно происходят процессы, которые могли бы вызывать быстрое внутриклеточное закисление. Во внутреннем сегменте клетки это интенсивный метаболизм, приводящий к образованию лахтата и CO2[/sub]. В наружном сегменте - процессы синтеза и гидролиза цГМФ. Ниже приводятся оценки интенсивности производства Н+[/sup] в ходе этих процессов.
Как отмечалось выше, сульфгидрильные группы родопсина функционально важны для активации трансдуцина и, следовательно, непосредственно участвуют в цикле фототрансдукции. Если это так, то их модификация должна приводить к изменениям фототока, регистрируемого в сетчатке или изолированной клетке. В настоящем разделе нами изложены эксперименты, подтверждающие это предположение. Однако оказалось, что при изменении фототока, вызванного модификацией SH-групп, обнаруживается компонент, который никак не может быть объяснен ингибированием или активацией ферментов, участвующих в усилении сигнала. Попытка объяснить этот феномен привела нас к исследованию ионных каналов в плазматической мембране клетки. В соответствующем разделе показано, что эти каналы также содержат функционально важные SH-группы, модификация которых может приводить к активации каналов и в отсутствие цГМФ.
Известно, что оксид азота (NO) играет важную роль в работе нервной системы. Гистохимические и иммуноцитохимические эксперименты с использованием NADPH-диафоразы показали, что NO-синтаза - фермент, образующий оксид азота из L-аргинина широко распространен в разных отделах мозга позвоночных. В сетчатке NO-синтаза была обнаружена в разных слоях: в эллипсоидах фото эецепторных клеток, амакриновых клеток, в мюллеровских клетках, в горизонтальных клетках, в биполярных клетках.
Наружные сегменты палочек сетчатки содержат разветвленную сеть цитоскелетных структур, в то время как в наружных сегментах колбочек цитоскелет гораздо менее развит.
Прежде всего это связано с чисто морфологическими особенностями. Палочки, работающие в условиях низких освещенностей, должны содержать намного больше зрительного пигмента и поэтому они намного длиннее колбочек. Основная функция цитоскелета - поддерживать правильную форму клетки и поэтому в палочках его морфологическая роль существенно выше. Однако как палочки, так и колбочки состоят из двух обособленных частей - наружного и внутреннего сегментов. Все метаболические процессы, необходимые для поддержание жизнедеятельности клетки, сосредоточены во внутреннем сегменте и поэтому их транспорт в наружный сегмент может быть значительно затруднен из-за больших размеров клеток. Существенную роль в этом процессе мог бы сыграть аксональный транспорт. В этом разделе представлены эксперименты, в которых с помощью ингибиторного анализа мы попытались подойти к исследованию вопроса об участии цитоскелета в регуляции процесса фототрансдукции.
Влияние модификации сулъфгидрильных групп на взаимодействие арестина с родопсином. Молекулу родопсина модифицировали MSL либо HgSL, а SH-группы арестина - HgSL. Фото- рецепторные мембраны, содержащие меченный или намеченный фосфорилированный родопсин, инкубировали с нативным или модифицированным арестином 20 мин при 20° С, затем мембраны саждали центрифугированием и определяли концентрацию не связавшегося арестина. Результаты опытов приведены в табл. 3.3.
Из таблицы видно, что модификация двух остатков родопсина MSL или двух других остатков HgSL практически не влияет на степень связывания арестина с родопсином, а константы диссоциации (Кд) комплексов арестина с родопсином, модифицированным MSL или HgSL, незначительно отличаются от величин Кл, определенных в контрольных экспериментах с немодифицированным родопсином. Таким образом, четыре поверхностных остатка цистеина Cys-140, Суs-316, Cys-322 и Cys-323, по-видимому, не участвуют в формировании центра связывания арестина на фосфорилированном родопсине. Примечательно, что и центр связывания cx-субъединицы транодуцина на родопсине не содержит SH-групп.
Влияние бикарбоната. Чтобы продемонстрировать влияние внутриклеточной концентрации бикарбоната на фотоответ зрительной клетки в растворе, содержащем вначале 12 мМ фосфатного буфера, 6 мМ фосфата замещалось на 6 мМ бикарбоната. Как показано выше, такая манипуляция должна приводить к возрастанию внутриклеточного рН, хотя экстраклеточный рН и буферная емкость по Н+ не изменялись. На рис. 6.15 приведены фотоответы зрительных клеток сетчатки лягушки. Под обозначениями А, Е и Г приведены группы из трех ответов на стимулы одинаковой интенсивности: А — низкой, В - средней и Г— высокой. Наименьший ответ был зарегистрирован при перфузии фосфатом без бикарбоната. Как только перфузирующий раствор заменяли на раствор Рингера, содержащий бикарбонат, ответ начинал расти. Средний ответ под каждым обозначением был зарегистрирован примерно через 15 мин после замены перфузирующего раствора. OTRCT, близкий к насыщающему СО- возрастал на 40%. Однако ответы, зарегистрированные при низкой интенсивности (А), возрастали относительно больше, что указывало на увеличение относительной чувствительности фоторецепторов.
Одним из ключевых белков участников процесса усиления сигнала в зрительной клетке является арестин. Подробно его свойства и роль в механизме деактивации сенсорного сигнала описаны в первых главах настоящей книги. Однако, как оказалось, арестин участвует и в других процессах, протекающих в сетчатке. Еще в 70-е годы прошлого века было установлено, что введение кролику водорастворимой фракции, полученной из сетчатки, индуцирует аутоиммунный увеит. Фактор, вызывающий аутоиммунный увеит, был назван S-антиген. Позже было установлено, что S антиген и арестин это один и тот же белок. Дальнейшие исследования показали, что у многих животных, включая приматов, вызванный S-антигеном экспериментальный увеит по своим клиническим проявлениям и гистологически похож на некоторые формы увеита у людей. Известно, что в индукции этого заболевания ключевую роль играет иммунная Т-система. Это позволяет предположить, что S-антиген играет определенную патогенную роль в индукции увеита. При некоторых формах увеита наблюдался как гуморальный, так и клеточный ответ на S-антиген.
Сетчатка - это единственная часть нервной системы, доступная свету. Известно, что избыток света способен привести к ее повреждению. Согласно эпидемиологическим данным, существует корреляция между интенсивностью и спектральным составом света, с одной стороны, и с развитием ряда глазных заболеваний, в частности, такого распространенного, как старческая макулярная дегенерация сетчатки, с другой.